配置RPMI-1640培養(yǎng)基的注意事項如下:
1)配制培養(yǎng)基最好使用新制備的三蒸水。一般在試驗前當天或前一天制備為好。調節(jié)pH值的酸堿溶液也應該使用這種水配制。
2)培養(yǎng)液配好后,應先抽取少許放入培養(yǎng)瓶內,于37℃溫箱內置24~48hr,以檢測培養(yǎng)液是否有污染。
3)溶解培養(yǎng)基:將干粉培養(yǎng)基溶于總量1/3的水中,再用水洗包裝袋內面兩次,倒入培養(yǎng)液中。振蕩或超聲助溶,一般不要加熱助溶。
4) 補加試劑:根據(jù)包裝袋說明和試驗需要加入NaHCO3(2.0g)、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等其他試劑。
5) 加抗生素:一般抗生素終濃度為――青霉素100U/ml,鏈霉素100U/ml。市售青霉素為80萬U/瓶,可溶于4ml體積,每一升培養(yǎng)液中加0.5ml即可。市售鏈霉素為100萬U/瓶,可溶于5ml體積,每一升培養(yǎng)液中也加0.5ml即可。無鏈霉素的情況下,用慶大霉素代替,終濃度調為50~200U/ml。
6) 調pH值:加水到900ml(在需要加10%小牛血清的情況下),然后用5% NaHCO3調節(jié)pH到7.2。
7) 過濾除菌:宜采用0.45um和0.22um濾膜各一張,上層為0.45um,下層為0.22um,以保證過濾效果。注意濾膜正面(光面)朝上。過濾后分裝于小瓶中(100或200ml)。
8) 加小牛血清:根據(jù)培養(yǎng)基配制的量將小牛血清分裝,冷凍保存(-20℃)。臨用前將加入小牛血清(10%~20%)。
9)每次配液時,需要的其他輔助性液體(Hanks,胰蛋白酶消化液,PBS,抗生素溶液等)也可以同時配制,分別過濾。
10)市售小牛血清使用前都應該滅活(56℃,30min),以消除補體活性。動物血清個體差異大,故而每一批血清都進行嚴格檢測,同時進行無菌試驗。優(yōu)質血清應該為淡黃色,透明,無溶血,無沉淀,滅活后顏色稍深。生化檢測總蛋白含量3.5~4.5g/100ml,球蛋白不高于2g/100ml。選定一個效果較好的批號后,可一次多購該批號的血清,保證試驗條件的穩(wěn)定。
11)由于市售小牛血清pH未知,但大多偏酸。試驗中加入小牛血清后,培養(yǎng)基的pH可能還會變化,故亦可先加入小牛血清后調pH值。但此種方法過濾較困難,只適于正壓過濾。
12)每次配液量以兩周左右為宜,一次配液不要太多,防止營養(yǎng)成分(主要為谷氨酰胺)損失,造成實驗繁瑣或者污染。
13)最后,制備培養(yǎng)基的器皿清洗要絕對干凈,烤干后備用(濾器、濾膜、量筒、移液管及盛放培養(yǎng)基的小瓶等存放和轉移培養(yǎng)基液體的器具都應進行滅菌)。