羅氏潮霉素B(Hygromycin B)是由吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)代謝產(chǎn)生的一種氨基糖苷類抗生素,大腸桿菌( Escherichia coli.)來源的潮霉素抗性基因(hyg或hph),編碼潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶,將潮霉素B轉(zhuǎn)化成不具有生物活性的磷酸化產(chǎn)物,從而起到解毒作用。
下面讓我們一起來了解一下羅氏潮霉素B的的使用步驟吧
案例一:殺滅曲線確定佳殺死濃度(僅作參考)
往組織培養(yǎng)級的96孔板內(nèi)加入未轉(zhuǎn)染細(xì)胞,細(xì)胞密度約50-200細(xì)胞/孔;細(xì)胞貼壁之后,往每孔加入含不同濃度(如50-1000μg/mL,至少5個(gè)濃度)潮霉素B的200μL新鮮培養(yǎng)基;
37℃,5% CO2培養(yǎng)箱孵育細(xì)胞10-14天;
培養(yǎng)5-7天后更換新的培養(yǎng)液,培養(yǎng)液內(nèi)含有相應(yīng)濃度的潮霉素B;
10-14天后使用細(xì)胞增殖方法如MTT,CCK-8等評估細(xì)胞活力;也可以通過檢測細(xì)胞克隆數(shù)或百分比匯合率來確定毒性效應(yīng)。一般選擇在10-14天能夠殺死所有細(xì)胞的小濃度為篩選濃度。
2.案例二:篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞
對于貼壁細(xì)胞,直接吸去60mm培養(yǎng)皿內(nèi)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)基,然后加入含有潮霉素B的新鮮培養(yǎng)基5-6ml;對于懸浮細(xì)胞,無菌條件250x g,離心10min除去舊的轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)基,然后懸浮在約5ml的含潮霉素B的新鮮培養(yǎng)基;
5-7天后,如上方法更換含有潮霉素B的新鮮培養(yǎng)基;
再孵育細(xì)胞5-7天;
10-14天孵育后,培養(yǎng)體系中只含有能夠表達(dá)潮霉素B抗性表型的活細(xì)胞。因此篩選之后如步驟一,更換不含潮霉素B的新鮮培養(yǎng)基。