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瓊脂糖凝膠電泳操作簡單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可以進(jìn)行電泳。瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結(jié)果可直接用紫外光燈檢測(cè)及定量測(cè)定。電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測(cè)定。制成干膜可長期保存。
瓊脂糖凝膠電泳也常用于分離、鑒定核酸，如DNA鑒定，DNA限制性內(nèi)切核酸酶圖譜制作等。由于這種方法操作方便，設(shè)備簡單，需樣品量少，分辨能力高，已成為基因工程研究中常用實(shí)驗(yàn)方法之一。本文主要給大家說說，瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA的原理及方法。
一、瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA的原理
瓊脂糖凝膠電泳是用于分離、鑒定和提純DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。瓊脂糖是從瓊脂中提取的一種多糖，具親水性，但不帶電荷，是一種很好的電泳支持物。DNA在堿性條件下(pH8.0的緩沖液)帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中通過凝膠介質(zhì)向正極移動(dòng)，不同DNA分子片段由于分子和構(gòu)型不同，在電場(chǎng)中的泳動(dòng)速率液不同。溴化乙錠(EB)可嵌入DNA分子堿基對(duì)間形成熒光絡(luò)合物，經(jīng)紫外線照射后，可分出不同的區(qū)帶，達(dá)到分離、鑒定分子量，篩選重組子的目的。
二、瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA的方法
瓊脂糖凝膠電泳對(duì)核酸的分離作用主要是依據(jù)它們的相對(duì)分子量質(zhì)量及分子構(gòu)型，同時(shí)與凝膠的濃度也有密切關(guān)系。
(1)核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關(guān)系
?、? DNA分子的大小在凝膠中，DNA片段遷移距離(遷移率)與堿基對(duì)的對(duì)數(shù)成反比，因此通過已知大小的標(biāo)準(zhǔn)物移動(dòng)的距離與未知片段的移動(dòng)距離時(shí)行比較，便可測(cè)出未知片段的大小。但是當(dāng)DNA分子大小超過20kb時(shí)，普通瓊脂糖凝膠就很難將它們分開。此時(shí)電泳的遷移率不再依賴于分子大小，因此，就用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA時(shí)，分子大小不宜超過此值。
?、?瓊脂脂糖的濃度。不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。
(2)核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系
不同構(gòu)型DNA的移動(dòng)速度次序?yàn)椋汗﹥r(jià)閉環(huán)DNA(covalently closed circular，cccDNA)>直線DNA>開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA。當(dāng)瓊脂糖濃度太高時(shí)，環(huán)狀DNA(一般為球形)不能進(jìn)入膠中，相對(duì)遷移率為0(Rm=0)，而同等大小的直線雙鏈DNA(剛性棒狀)則可以長軸方向前進(jìn)(Rm>0)，由此可見，這三種構(gòu)型的相對(duì)遷移率主要取決于凝膠濃度，但同時(shí)，也受到電流強(qiáng)度、緩沖液離子強(qiáng)度等的影響。
三、瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA的實(shí)驗(yàn)步驟
1、安裝電泳槽
將有機(jī)玻璃的電泳凝膠床洗凈，晾干，用膠帶將兩端的開口封好，放在水平的工作臺(tái)上，插上樣品梳。
2、瓊脂糖凝膠的制備
稱取瓊脂糖溶解在電泳緩沖液中，(按0.3-1.5%的瓊脂糖含量，1-25kb大小的DNA用1%的凝膠，20-100kb的DNA用0.5%的凝膠，200-2000bp的DNA用1.5%的凝膠)置微波爐或沸水浴中加熱至*溶化(不要加熱至沸騰)，取出搖勻。
3、灌膠
將冷卻到60℃的瓊脂糖溶液輕輕倒入電泳槽水平板上。
4、待瓊脂糖膠凝固后，在電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液，然后拔出梳子。
5、加樣
將DNA樣品與加樣緩沖液按4：1混勻后，用微量移液器將混合液加到樣品槽中，每槽加10-20μl，記錄樣品的點(diǎn)樣次序和加樣量。
6、電泳
安裝好電極導(dǎo)線，點(diǎn)樣孔一端接負(fù)極，另一端接正極，打開電源，調(diào)電壓至3-5V/cm，電泳1-3hr，當(dāng)溴酚藍(lán)移到距凝膠前沿1-2cm時(shí)，停止電泳。
7、染色和觀察
取出凝膠，放在含有溴化乙錠的染色液中染色30min，即可在254nm的紫外燈下觀察，有橙紅色熒光條帶的位置，即為DNA條帶，或在紫外燈下照相記錄電泳圖譜。溴化乙錠是致癌劑，操作時(shí)要小心，必須戴手套。
四、實(shí)驗(yàn)器具及藥品
電泳儀，電泳槽，紫外透射反射儀，恒溫水浴鍋，微波爐，微量進(jìn)樣器，三羥甲基氨基甲烷，鹽酸，醋酸鈉，EDTA，瓊脂糖，溴酚藍(lán)，溴化乙錠。
當(dāng)前位置：